中国传统的DNA克隆具体做法步骤一般主要包括禁止性酶切与链接的具体做法步骤，能够运行禁止性内切酶切学习最终目标DNA场面描写和克隆质粒，然而运行DNA链接酶将三者链接在一起。比如本身具体做法步骤现实存在无数疵点，比如学习最终目标DNA场面描写或克隆质粒不足适的酶切位点，就必须要来进行另外构建酌情的字段或运行某个禁止性内切酶，费时很紧，工作繁冗，甚至禁止性酶切与链接具体做法步骤的链接学习效率和准确度性可能会性给予多类各种客观因素的不良反应，如酶切位点的系统性、链接酶的机关效能和状态、链接不良反应的的温度和耗时等。非常多各种客观因素都可能会性使得链接生成物的齐全性和不判断性。 

源于协同机制的无缝焊接克隆系统，最为第四代名将的克隆方法方法步骤，不依懒死板的酶切、进行链接方法步骤，可是需最末端补公平进行操作，能能合理有效克服害怕束缚性酶切与进行链接的优点和缺点，前提条件DNA段落与曲线化质粒最末鍴的15~25 nt同源队列的协同，可将进到这一领域段落克隆至同样曲线质粒的同样位点，质粒自连原型越来越低，是一个种比较简单、加快、更高效的DNA定向招生克隆系统。

 Biogradetech的FlyCut? DNA Assembly Mix Plus无缝克隆预混液，一次反应可完成单至多个 DNA 片段的重组，最快仅需 5分钟即可完成单片段重组，且阳性率高于95%。预混液中添加的辅助因子，有效提高克隆阳性率；经优化的反应体系，能够一定程度上耐受未纯化 PCR 产物中含有的杂质。升级版的无缝克隆试剂盒具有更高的阳性率、更好的兼容性。

货号	欧宝体育官方:C-BSM1202-50rxns
名称	FlyCut? DNA Assembly Mix Plus 快速多片段DNA无缝克隆预混液
组分	FlyCut? DNA Assembly Mix Plus——250ul pUC19 Control Plasmid,Linearized (Amp, 40 ng/ul)——5ul 500 bp Control Fragment (20 ng/ul)——5ul
优势	使用简单：兼容PCR与酶切体系，省去繁琐的纯化步骤 超高效率：可以稳定支持5-6片段在同一克隆体系 稳定可靠：37℃放置一周或冻融30次，无明显下降

多片段DNA无缝克隆流程

1.线性化克隆载体制备

选泽合适的的克隆位点，对各种质粒进行线形化，各种质粒的线形化可不可以用酶切或反向的方式给回 PCR 扩张完毕。 1.1酶切配制：一系制约性内切酶不是有效的地消化不良超雷韵 DNA，于是可能性会留下来差异數量的未切开平台 DNA，影响呈抗体阳性率。推介安全使用 FlyCut?快内切酶采取酶切（单酶切亦或是双酶切），使平台波形化已经，以影响转换成背静（未切开的平台转换成提升的假呈抗体阳性克隆） 1.2方向 PCR测序制作：为减小测序变异的转化，个性化推荐在安全使用高货真 PCR Mix 通过测序。推 荐在安全使用预波形化质粒身为模板图片图片，以减小环状质粒模板图片图片残留物对克隆阳性反应率的决定。

2.插入片段PCR引物设计

PCR 引物的5'端必需一般包括与他之间精彩精彩片段（读取精彩精彩片段或质粒平台）最最末端同源的15~25 nt（推荐英文18 nt）编码序列。假若质粒平台为磁性最最末端，且3' 端出色，则引物制作必需一般包括出色环节；若5'端出色，则引物制作是可以一般包括出色环节，也是可以不一般包括。 进到这一领域电影片段正在向着测序引物：5'-上中下游媒体未端同源编码队列+酶切位点（要选）+染色体特男人正在向着测序编码队列- 3' 添加电影片段逆向测序引物：3'-DNA特喜欢的人逆向测序字段+酶切位点（先选）+中游媒体最末端同源字段-5'  

本欧宝体育官方 里面提供了的pUC19膜蛋白（Ampr）连入端回文序列下列：

3.插入片段的 PCR 扩增

选择适用高正品保证PCR 预混液做好增加，以降低增加突变的的引用。意见建议食用纯化后的 PCR 货物开展无缝对接克隆不良想法，若PCR货物经琼脂糖疑胶电泳检测为特男人测序货物，可可以食用，但加样球体积大概还应少于总不良想法球体积大概的20%。  

4.重组反应

4.1于冰水浴中配置以下反应体系：

组分	反应体系	阴性对照	阳性对照 (可选)
FlyCut? DNA Assembly Mix Plus	5ul	5ul	5ul
线性化载体（a）	50~200 ng	50~100 ng	pUC19 Control Plasmid,Linearized, 1ul
插入片段（b）	10~200 ng	-	500 bp Control, Fragment, 1 ul
ddH2O	共计10ul

（a）最适形式使用量 (ng) = 0.02 ×形式碱基对数计算，即03 pmol。（b）加入单支段，最适场面描写需水量（ng）= 0.04 ×场面描写碱基常用多数；加入多场面描写，每场面描写最适需水量（ng）= 0.02 ×场面描写碱基常用多数。 重组方案反馈模式配好的凉茶提交后，用移液枪用适当的力度轻轻吸打混匀各多组分，防范 产生泡泡，切不可涡旋式。 4.2将表现机制置入 50℃，表现 5~60 min。 4.3将反应迟钝液离心力管置放雪上水冷却，过后来和转化了还是储藏于 -20℃。  

5.重组产物转化

取 5~10ul反映液，成为到100ul感言态細胞中，变慢吸打混匀，冰面放 30 min。42℃热激 45~60 sec，冰浴5 min。加500ul SOC或LB训练基，37℃ 自激振荡训练40~60 min（200 rpm）。将菌液匀称涂布纸在含相对应的消炎药的平板电脑苹果上，颠倒于37℃一晚训练。  

6.阳性克隆检测

挑取单菌落至10ul ddH2O中混匀，95℃裂解10min后，取1ul裂解液用作模板制作，完成菌落PCR判定，或将单菌落注射至抗性培養基中培養留宿后，提现质粒完成酶切判定。呈阳性反应照表的呈阳性反应克隆查测，菌落PCR引物动用通用的引物M13F与M13R，酶切判定用HindIII与EcoRI。M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT M13R：CAGGAAACAGCTATGAC   

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