傳統的DNA克隆具体方案常见应用限确定酶切与接入的具体方案，能够的采用的限确定内切酶激光切任务DNA情节和克隆平台，之后的采用的DNA接入酶将二者接入好。可是这般具体方案会有多偏差，假若任务DNA情节或克隆平台或缺適合的酶切位点，就要实行增加引出合适的回文序列或的采用的别的限确定内切酶，费时费劲，的过程繁冗，另外限确定酶切与接入具体方案的接入能力和精密性将遭受四种方面的关系，如酶切位点的完正性、接入酶的性能和环境、接入体现的水温和时段等。多方面都将引起接入副产物的齐全性和不来确确定。 

依托于资产重新组合关键的技巧的无逢克隆的技巧，作为一个新时代人的克隆方案，不依赖性繁复的酶切、无线连到步驟，也没有要求终端补平等权工作，需要更好不要受到约束性酶切与无线连到的弱点，数据DNA情节与曲线化各种质粒平台终中端15~25 nt同源队列的资产重新组合，可将复制情节克隆至随意尺寸曲线各种质粒平台的随意尺寸位点，各种质粒平台自连后台过低，有的是种简略、尽快、高效、性价比最高的DNA定向委培克隆的技巧。

 Biogradetech的FlyCut? DNA Assembly Mix Plus无缝克隆预混液，一次反应可完成单至多个 DNA 片段的重组，最快仅需 5分钟即可完成单片段重组，且阳性率高于95%。预混液中添加的辅助因子，有效提高克隆阳性率；经优化的反应体系，能够一定程度上耐受未纯化 PCR 产物中含有的杂质。升级版的无缝克隆试剂盒具有更高的阳性率、更好的兼容性。

货号	C-BSM1202-50rxns
名称	FlyCut? DNA Assembly Mix Plus 快速多片段DNA无缝克隆预混液
组分	FlyCut? DNA Assembly Mix Plus——250ul pUC19 Control Plasmid,Linearized (Amp, 40 ng/ul)——5ul 500 bp Control Fragment (20 ng/ul)——5ul
优势	使用简单：兼容PCR与酶切体系，省去繁琐的纯化步骤 超高效率：可以稳定支持5-6片段在同一克隆体系 稳定可靠：37℃放置一周或冻融30次，无明显下降

多片段DNA无缝克隆流程

1.线性化克隆载体制备

选择为宜的克隆位点，对形式实现线型化，形式的线型化行可以通过酶切或单向 PCR PCR扩增实现。 1.1酶切光催化原理：一系列受到约束性内切酶可以能够地代谢超雷韵 DNA，这样应该会产生有所不同需求量的未水刀水刀切割承载 DNA，大幅度调低呈阳型率。推送实用 FlyCut?如何快速内切酶实行酶切（单酶切亦或双酶切），使承载平滑化可以，以大幅度调低变为率原型（未水刀水刀切割的承载变为率收获的假呈阳型克隆） 1.2返向 PCRPCR测序制法：为减掉PCR测序突变性的转化，推见便用高货真 PCR Mix 进行PCR测序。推 荐便用预平滑化质粒最为模版，以减掉环状质粒模版残存对克隆呈阳性率的导致。

2.插入片段PCR引物设计

PCR 引物的5'端须得构成和它之间场面（添加图片场面或各种质粒）末梢同源的15~25 nt（安利18 nt）编码序列。如果你各种质粒为磁性末梢，且3' 端明显突显出，则引物来设计构思须得构成明显突显出位置；若5'端明显突显出，则引物来设计构思可构成明显突显出位置，也可不构成。 添加图片片断顺向增加引物：5'-中上游平台最末端同源编码队列+酶切位点（可选择）+dna特异形顺向增加编码队列- 3' 插入表格电影片段返向扩张引物：3'-基因遗传特女性朋友返向扩张编码队列+酶切位点（自选）+上中游膜蛋白终端同源编码队列-5'  

本欧宝体育官方 中提拱的pUC19膜蛋白（Ampr）连入端回文序列以下的：

3.插入片段的 PCR 扩增

推荐英文在使用高正品PCR 预混液做好扩张，以增多扩张转变的机遇。意见与建议便用纯化后的 PCR 物质来无逢克隆生理反應，若PCR物质经琼脂糖疑胶电泳检验为特情人测序物质，可之间便用，但加样质量应为不低于总生理反應质量的20%。  

4.重组反应

4.1于冰水浴中配置以下反应体系：

组分	反应体系	阴性对照	阳性对照 (可选)
FlyCut? DNA Assembly Mix Plus	5ul	5ul	5ul
线性化载体（a）	50~200 ng	50~100 ng	pUC19 Control Plasmid,Linearized, 1ul
插入片段（b）	10~200 ng	-	500 bp Control, Fragment, 1 ul
ddH2O	共计10ul

（a）最适平台容量 (ng) = 0.02 ×平台碱基常用对数，即03 pmol。（b）复制片式段，最适场面用水量（ng）= 0.04 ×场面碱基多数计算；复制多场面，每场面最使用水量（ng）= 0.02 ×场面碱基多数计算。 合拼不良反应体制自制完毕后，用移液枪悄悄的吸打混匀各多组分，制止 导致泡泡，不应涡旋式。 4.2将反應体系中放入 50℃，反應 5~60 min。 4.3将体现液离心分离管放置在冰面冷却水，时候确定转化成亦或是贮存于 -20℃。  

5.重组产物转化

取 5~10ul发应液，申请加入到100ul感言态血细胞中，慢慢吸打混匀，雪上存放 30 min。42℃热激 45~60 sec，冰浴5 min。加500ul SOC或LB陪养基，37℃ 谐振陪养40~60 min（200 rpm）。将菌液一致刷抹在有效相应抗菌药的平板电脑苹果上，反过来于37℃一晚陪养。  

6.阳性克隆检测

挑取单菌落至10ul ddH2O中混匀，95℃裂解10min后，取1ul裂解液充当模板制作，开始菌落PCR监定，或将单菌落打疫苗至抗性陪养计划基中陪养计划住宿后，提炼质粒开始酶切监定。阳型剖析的阳型克隆加测，菌落PCR引物采用基础引物M13F与M13R，酶切监定用HindIII与EcoRI。M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT M13R：CAGGAAACAGCTATGAC   

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